06/05/2020

Protocolo simples para utilização da Taq DNA Polimerase Master Mix Red

Protocolo simples para utilização do 2X Taq DNA Polimerase Master Mix Red em testes de alto rendimento de genótipos de camundongos.

Esta nota de aplicação descreve o uso do Taq DNA Polimerase Master Mix RED, da Ampliqon, para amplificação rápida de DNA genômico a partir de tecidos de caudas de ratos.

Antes da amplificação, o DNA genômico bruto é extraído de caudas de camundongo em aproximadamente 90 minutos, através do método de extração por NaOH: preparação rápida de DNA. (Referência: Truett GE et al. 2000. Biotechniques 29 (1): 52-54.)


Características de aplicação:

• Genotipagem usando tecido da cauda do rato

• Protocolo de extração fácil - DNA genômico de caudas de camundongo obtido em 90 minutos

• Resultados obtidos 3-4 horas após a amostragem das caudas de camundongos

• Ideal para testes de alto rendimento

• O DNA pode ser diluído 1: 100

• O DNA pode ser armazenado a -20 ° C> 6 meses

• Corante vermelho incluído no Taq DNA Polymerase Master Mix RED para carregamento direto do gel de agarose, e análise de PCR durante o gel de eletroforese



Os fragmentos de DNA foram extraídos a partir de tecidos cauda de ratos pelo método de NaOH. A amplificação foi realizada usando o 2x Taq DNA Polimerase Master Mix RED. O resultado final foi obtido em 3 a 4 horas após a amostragem e foi observado em gel de eletroforese, comparados a protocolos de extração padrão por mais de 1 dia.

Cada extrato não diluído fornece amostras suficientes para reações múltiplas PCR, e pode ser facilmente manipulada no formato de placas de 96 poços, geralmente para laboratórios com alto fluxo de testes.

Os extratos podem ser diluídos 1: 100, dependendo da concentração de DNA e da condição do ensaio. Os extratos (diluídos ou não diluídos) são estáveis a -20 ° C por pelo menos 6 meses.

O 2X Taq DNA Polimerase Master Mix RED é pronto para o uso, e contém todos os componentes para uma reação de PCR confiável, exceto primers e amostras de DNA. Seu corante vermelho é inerte e estabilizante, e permite o carregamento da reação de PCR direto no gel de agarose, sem a necessidade de adicionar outros corantes e tampões.



Fragmentos de DNA gerados com Taq 2x Master Mix RED são da cauda de 3'-dA e podem ser clonados no TA.




1- Extração do DNA de tecidos da cauda do rato.

Amostra para extração por NaOH (preparação rápida de DNA).


→ Corte 2 mm de cauda e coloque em um tubo Eppendorf ou em uma placa de 96 poços

→ Adicione 75 µl de NaOH 25 mM / EDTA 0,2 mM

→ Coloque no termociclador a 98 ° C por 1 hora e reduza a temperatura para 15 ° C

até que esteja pronto para prosseguir para a próxima etapa

→ Adicione 75 µl de Tris HCl 40 mM (pH 5,5)

→ Centrifugar a 4000 rpm por 3 minutos

→ Faça uma alíquota para PCR (use 2 µl não diluído ou 2 µl de uma diluição / reação 1: 100)


2 – Protocolo de PCR

Pipete a seguinte mistura de reação.

Para mais de uma amostra, aumente os volumes e adicione 10% de volume extra.




Protocolo de PCR


3 – Programa de PCR no termociclador


Programa de PCR no termociclador

4 – Eletroforese

Carregue 10 µl do produto de PCR diretamente em um gel de agarose.
A porcentagem de agarose depende do tamanho esperado do produto.

Eletroforese

5 – Análises e Resultados
Análises e Resultados

Guilherme Ramanzini

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