Protocolo simples para utilização do 2X Taq DNA Polimerase Master Mix Red em testes de alto rendimento de genótipos de camundongos.

Esta nota de aplicação descreve o uso do Taq DNA Polimerase Master Mix RED, da Ampliqon, para amplificação rápida de DNA genômico a partir de tecidos de caudas de ratos.

Antes da amplificação, o DNA genômico bruto é extraído de caudas de camundongo em aproximadamente 90 minutos, através do método de extração por NaOH: preparação rápida de DNA. (Referência: Truett GE et al. 2000. Biotechniques 29 (1): 52-54.)

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Características de aplicação:

• Genotipagem usando tecido da cauda do rato

• Protocolo de extração fácil - DNA genômico de caudas de camundongo obtido em 90 minutos

• Resultados obtidos 3-4 horas após a amostragem das caudas de camundongos

• Ideal para testes de alto rendimento

• O DNA pode ser diluído 1: 100

• O DNA pode ser armazenado a -20 ° C> 6 meses

• Corante vermelho incluído no Taq DNA Polymerase Master Mix RED para carregamento direto do gel de agarose, e análise de PCR durante o gel de eletroforese

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Os fragmentos de DNA foram extraídos a partir de tecidos cauda de ratos pelo método de NaOH. A amplificação foi realizada usando o 2x Taq DNA Polimerase Master Mix RED. O resultado final foi obtido em 3 a 4 horas após a amostragem e foi observado em gel de eletroforese, comparados a protocolos de extração padrão por mais de 1 dia.

Cada extrato não diluído fornece amostras suficientes para reações múltiplas PCR, e pode ser facilmente manipulada no formato de placas de 96 poços, geralmente para laboratórios com alto fluxo de testes.

Os extratos podem ser diluídos 1: 100, dependendo da concentração de DNA e da condição do ensaio. Os extratos (diluídos ou não diluídos) são estáveis a -20 ° C por pelo menos 6 meses.

O 2X Taq DNA Polimerase Master Mix RED é pronto para o uso, e contém todos os componentes para uma reação de PCR confiável, exceto primers e amostras de DNA. Seu corante vermelho é inerte e estabilizante, e permite o carregamento da reação de PCR direto no gel de agarose, sem a necessidade de adicionar outros corantes e tampões.



Fragmentos de DNA gerados com Taq 2x Master Mix RED são da cauda de 3'-dA e podem ser clonados no TA.




1- Extração do DNA de tecidos da cauda do rato.

Amostra para extração por NaOH (preparação rápida de DNA).


→ Corte 2 mm de cauda e coloque em um tubo Eppendorf ou em uma placa de 96 poços

→ Adicione 75 µl de NaOH 25 mM / EDTA 0,2 mM

→ Coloque no termociclador a 98 ° C por 1 hora e reduza a temperatura para 15 ° C

até que esteja pronto para prosseguir para a próxima etapa

→ Adicione 75 µl de Tris HCl 40 mM (pH 5,5)

→ Centrifugar a 4000 rpm por 3 minutos

→ Faça uma alíquota para PCR (use 2 µl não diluído ou 2 µl de uma diluição / reação 1: 100)

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2 – Protocolo de PCR

Pipete a seguinte mistura de reação.

Para mais de uma amostra, aumente os volumes e adicione 10% de volume extra.

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3 – Programa de PCR no termociclador

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4 – Eletroforese

Carregue 10 µl do produto de PCR diretamente em um gel de agarose.
A porcentagem de agarose depende do tamanho esperado do produto.

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5 – Análises e Resultados


Guilherme Ramanzini

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