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Desde a descoberta da técnica da PCR, os avanços tecnológicos surgiram para acompanhar as demandas e aplicações nas mais variadas áreas. Devido a sua alta sensibilidade, a técnica se tornou gold standard em diversos testes diagnósticos e pesquisa. No entanto, a comunidade científica e as indústrias farmacêuticas exigem reações com grande especificidade, eficiência, reprodutibilidade e custos cada vez menores.
A alta especificidade da técnica é garantida com protocolos padronizados mantendo todos os cuidados para evitar contaminações de amostras e uso de reagente inespecíficos. O uso de Master Mix nas reações de PCR proporciona praticidade ao mesmo tempo que reduz erros de manipulação e pipetagem, o que torna ideal para aplicações de alto rendimento.
O Master Mix RealQ Plus padrão da Ampliqon é um Master Mix robusto e confiável para reações de PCR em tempo real. Avaliou-se a possibilidade de redução do tempo de etapas do ciclo térmico a fim de se verificar o rendimento e eficiência dessas reações em protocolo de ciclo rápido. Os resultados mostraram alta eficiência da reação em até 50% menos tempo.
Os protocolos de ciclo rápido, de duas etapas foram aplicados usando tanto o RealQ Plus 2x Master Mix for Probe como o RealQ Plus 2x Master Mix Green e foram executados em três termocicladores de PCR em tempo real: LightCycler® 96, Mx3500P e StepOnePlus™ com redução de tempo das etapas de desnaturação e extensão. 
Dois protocolos diferentes foram testados em cada um dos três instrumentos de PCR em tempo real usando dois alvos de comprimento diferentes; PAH12 (203 pb) e Pthr (75 pb). Todos os seis protocolos com ciclo rápido testados mostraram alta precisão e eficiência. Os valores como o coeficiente de correlação (R2) que é a medida de como os pontos se ajustam na curva padrão, e o ciclo quantitativo (Cq), que representa o número de ciclos necessários para que o sinal de fluorescência atinja o limiar de detecção foram analisados. Verificou-se que os valores obtidos para os protocolos de ciclo rápido testados estão dentro dos critérios normalmente definidos para o protocolo padrão do Master Mix RealQ Plus.
Dependendo do instrumento de PCR em tempo real aplicado e do alvo de DNA usado, com redução das etapas de desnaturação e extensão, os tempos totais de execução variam em aproximadamente 41 – 61 minutos o que representa redução significativa em comparação com o protocolo padrão com um tempo total de execução de aproximadamente 83 minutos.
Vale ressaltar que ao realizar PCR em tempo real com protocolo de ciclo rápido, deve-se considerar o design do primer e o tamanho do alvo. Para amplificação eficiente durante as condições de ciclagem rápida, é recomendado que o tamanho do alvo esteja entre 70 bp e 200 bp. Quanto menor o comprimento do alvo, mais rápido o tempo total de execução. Para outros alvos e outros conjuntos de primers, a etapa de anelamento deve ser determinada experimentalmente.
Temos assim um Master Mix standard que pode ser utilizado como um Master Mix fast!!! Para isso basta alterar as configurações de ciclagem do equipamento utilizado o que proporciona vantagens como: economia de tempo, aumento de rendimento no laboratório e aumento de disponibilidade de instrumentos no laboratório.
