10/06/2020

A Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

A Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é uma técnica utilizada quase que universalmente em laboratórios de lifesciences. O objetivo desta técnica é separar uma amostra de proteínas para identificar e quantificar proteínas.

A amostra inicial pode vir de qualquer fonte, como amostra de paciente, tecido homogeneizado ou cultura bacteriana. A eletroforese PAGE também pode ser utilizada para separar DNA e RNA, porém, as proteínas são o tipo de amostra mais comum.

A PAGE é frequentemente combinada com uma técnica chamada western blotting. O Blotting utiliza anticorpos para se ligar a antígenos protéicos específicos e, portanto, permite identificar proteínas individuais com alta especificidade.



Como funciona?

Existem vários tipos de técnica de PAGE, mas o mais comum é chamado SDS-PAGE. No SDS-PAGE, o detergente dodecilsulfato de sódio (SDS) é usado para desnaturar as proteínas e normalizar sua proporção massa / carga. Sem o SDS, o peso molecular e a carga da proteína afetariam a separação no gel.

Com o SDS, apenas o peso molecular afeta a velocidade de migração e, portanto, as amostras são separadas de acordo com isso. PAGE sem SDS é chamado PAGE nativo, pois as proteínas permanecem em sua conformação nativa.

A matriz de gel

Como na eletroforese em gel de agarose, as amostras de proteínas são separadas usando um campo elétrico e passam por uma matriz de gel que influencia a migração das proteínas. Em PAGE, em vez da agarose, usamos um produto químico chamado poliacrilamida.

A variação da porcentagem de poliacrilamida no gel permite alterar o tamanho dos poros do gel, o que significa que podemos separar diferentes tamanhos de proteína em diferentes porcentagens das concentrações de géis. As porcentagens típicas de gel são mostradas na tabela abaixo.

Porcentagem de Acrilamida

Resolução da separação

5 %

60 – 220 Kd

7.5 %

30 – 120 Kd

10 %

20 – 75 Kd

12%

17 – 65 Kd

15 %

15 -45 Kd

17.5%

12 – 30 Kd



A acrilamida é normalmente vendida na forma líquida, pois a forma em pó é neurotóxica e perigosa de manusear. A polimerização é obtida misturando acrilamida com bis-acrilamida, o que permite a formação de ligações cruzadas entre as moléculas de acrilamida. Alguns produtos químicos são adicionados para iniciar a polimerização, geralmente persulfato de amônio como fonte de radicais livres e TEMED como estabilizador.

Uma vez iniciada a polimerização, o gel é vertido entre 2 placas de vidro e deixado polimerizar completamente. A mistura de gel é composta em tampão de eletroforese (Tris-HCl), que fornece os íons para a formação da corrente na eletroforese. Muitas vezes, o gel é derramado em 2 partes.

A primeira parte é um gel de resolução, com um pH em torno de 8,8, o que diminui a migração das proteínas. Em cima do gel de resolução, é derramado um gel de empilhamento, com um pH de 6,8 e, com poros maiores.

Esse gel de empilhamento trabalha para comprimir as amostras de proteínas em uma frente fina de migração, de modo que todas as proteínas da amostra cheguem ao gel de resolução ao mesmo tempo, levando a uma migração relativa precisa.


Executando o gel

Ao contrário da eletroforese em gel de agarose, em que os géis são moldados em bandejas e executados horizontalmente, os géis SDS-PAGE são moldados verticalmente usando o gel caster. Os géis são moldados dessa maneira, para que ambos os géis, de empilhamento e resolução, formem um gel contínuo, e permite que uma quantidade muito maior de proteína seja carregada no gel.

A cuba vertical de gel de eletroforese também é dividido em 2 seções. Dependendo do fabricante, a cuba de eletroforese terá uma câmara superior(interna) e uma câmara inferior (externa). Essas duas câmaras são ligadas pelo gel de poliacrilamida para criar um circuito contínuo. Cada câmara contém um eletrodo, negativo na câmara interna e positivo na câmara externa.

A câmara interna entra em contato com o topo do gel e, quando um campo elétrico é aplicado, as proteínas se direcionam para o eletrodo positivo na câmara tampão externa, devido às cargas negativas das moléculas de SDS. Os tampões típicos para SDS-PAGE são Tris-Glicina para as câmaras tampão e Tris-HCl para o gel.

A velocidade da migração através do gel é determinada pelo gradiente de voltagem, isto é, a voltagem entre os eletrodos. A força de campo necessária está relacionada ao tamanho da cuba de eletroforese utilizada e a voltagem necessária pode ser calculada usando a equação: E = V / d, onde "E" é a força de campo, "V" a voltagem e "d" a distância em centímetros entre os eletrodos.

Para aplicar esse campo elétrico, usamos uma fonte de alimentação. A maioria das fontes de eletroforese pode ser configurada para fornecer corrente e voltagem constantes, cada uma com vantagens e desvantagens.

Uma questão em potencial é a produção de calor devido ao fluxo de corrente através do sistema, que pode ser especialmente alto em cubas maiores, que requerem uma voltagem mais alta.

Por esse motivo, é aconselhável usar alguma forma de resfriamento, passivo na forma de um bloco de resfriamento ou ativo como um chiller de recirculação, para sistemas de eletroforese maiores.

Visualizando a proteína

Após a migração, as proteínas devem ser visualizadas para determinar seu comprimento e abundância. Existem vários métodos comumente usados para visualizar proteínas específicas ou não específicas.

A visualização não específica tem como alvo todas as proteínas, usando corantes que se ligam a regiões comuns das proteínas, como os grupos amino.

Exemplos de corantes de proteína não específicas incluem Coomassie Brilliant Blue e Ruby Pro. Esses corantes geralmente não são reversíveis e podem (mas nem sempre) interferir nas aplicações downstream. A coloração não específica pode ser útil para quantificar rapidamente as amostras em um gel ou para garantir a presença de uma amostra de interesse.

Para visualizar especificamente certas proteínas, precisamos usar anticorpos. Os anticorpos reconhecem estruturas tridimensionais únicas na proteína para distingui-los dos outros.

Ao conjugar o anticorpo com um corante ou enzima, podemos visualizar apenas a proteína que ele reconhece. O processo de mover proteínas de um gel para uma membrana que pode ser sondada com anticorpos é chamado western blotting. Para saber mais sobre western blotting, você pode ler nosso artigo dedicado em breve.

Independentemente de você ser Western Blotting ou apenas uma coloração inespecífica, será necessário visualizar as proteínas usando o sistema de documentação em gel. O tipo de sistema usado varia de acordo com o uso de um corante visível como coomassie ou corante fluorescente ou quimioluminescente anexado a um anticorpo.

Assim como nos sistemas de documentação em gel de agarose, os sistemas de documentação em gel para proteínas podem apresentar uma variedade de especificações, dependendo dos requisitos. Para obter mais conselhos sobre documentos em gel, você pode ler nosso artigo dedicado.



Video Demonstrativo


Aplicações

SDS-PAGE e outras formas de eletroforese em gel de poliacrilamida são amplamente utilizadas em pesquisas acadêmicas em biologia celular e molecular. A capacidade de separar, identificar e quantificar os níveis de proteínas em certas células e ambientes é essencial para entender como os processos celulares funcionam. Devido à onipresença dessas técnicas, qualquer fluxo de trabalho que envolva proteínas provavelmente as inclua, desde uma simples verificação do conteúdo total de proteínas até a quantificação total de proteoma, usando espectrometria de massa.


Equipamentos para eletroforese em gel de poliacrilamida

Equipamentos para eletroforese em gel de poliacrilamida


Componentes do tanque de eletroforese em gel de poliacrilamida omniPAGE


Componentes do tanque de eletroforese em gel de poliacrilamida omniPAGE

Cuba de Eletroforese Vertical

As cubas de gel usados na eletroforese vertical / SDS-PAGE diferem dos tanques de gel de agarose de várias maneiras. Como os géis de poliacrilamida são executados na orientação vertical, o cuba de gel inclui um módulo para manter as placas de vidro na posição vertical.

A maioria das cubas modernas de PAGE usa as placas de vidro para criar a câmara de tampão interna, prendendo-as uma contra a outra, em forma de U, criando assim uma seção entre as duas placas, que é separada do restante da câmara pelo gel.

O módulo interno de operação fica dentro da cuba de gel e, em seguida, é conectada uma tampa que liga o tanque à fonte de alimentação através dos eletrodos.

A Cleaver Scientific fabrica uma variedade de cubas de eletroforese para gel de poliacrilamida, todas compatíveis com gel casters e com módulos de westernblotting.

Nosso popular mini tanque omniPAGE é compatível com todos os géis pré-fabricados disponíveis no mercado, tornando-o ideal para separações rápidas de proteínas de rotina


Fontes de Energia

Para geral um campo elétrico ao gel, você precisará de uma fonte de alimentação de eletroforese. Essas fontes de alimentação são fabricadas especificamente para aplicações de eletroforese e apresentam saídas de tensão e corrente muito estáveis para evitar flutuações na velocidade durante as corridas.

Uma boa fonte de eletroforese permite que você defina corrente ou voltagem constantes, dependendo da necessidade do experimento, e fontes mais avançadas permitirão a programação de etapas individuais com diferentes valores de parâmetros.

Na Cleaver Scientific, temos uma variedade de fontes de alimentação por eletroforese para todas as aplicações. A série PowerPRO de fontes de alimentação é uma gama versátil projetada para alimentar tanques de eletroforese horizontal multiSUB e omniPAGE vertical.

Cada fonte de alimentação possui um display LCD de 2,4 ″. Opções de voltagem constante, corrente e potência estão disponíveis, bem como condições pré-programadas ou programadas pelo cliente, permitindo que os usuários salvem e repitam suas experiências para uma reprodutibilidade excepcional.

Sistema de documentação em gel

Para o estágio final da técnica, a geração de imagens em gel, você precisará de um sistema de fotodocumentação em gel, conforme descrito acima.

A Cleaver Scientific possui toda uma gama de sistemas de fotodocumentadores em gel para atender a qualquer orçamento ou necessidade. Você pode também ver nossos sistemas de fotodocumentadores em gel de agarose no artigo sobre eletroforese em gel de agarose.

Para os sistemas de fotodocumentação de gel para western blotting/ SDS-PAGE, veja abaixo:


Sistema de documentação em gel


Reagentes para eletroforese em gel de poliacrilamida

Para executar um experimento de eletroforese em gel de poliacrilamida, você precisará do equipamento e dos reagentes. Os reagentes básicos necessários para a eletroforese em gel de poliacrilamida são:

Acrilamida, TEMED e APS para fazer géis

Tampões

Corantes carregadores para visualização das proteínas nas corridas

Ladders proteínas para comparar tamanho e quantidade de proteínas

Corantes de proteínas para visualizar proteínas


Fonte: Cleaver Scientific

www.neobio.com.br
(14) 3880-5999
(14) 9-9663-1749