A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) revolucionou a biologia molecular, permitindo a amplificação precisa de fragmentos de DNA. Seja na sua forma convencional ou em Tempo Real, a PCR é uma ferramenta fundamental em laboratórios de pesquisa, diagnóstico e forense. No entanto, a contaminação é um desafio persistente que pode comprometer a precisão e a confiabilidade dos resultados.



Neste artigo, exploraremos os diversos tipos de contaminação que podem ocorrer em reações de PCR convencionais e em tempo real, os impactos que podem ter nos resultados e as estratégias para minimizar esse problema.



Contaminação na PCR Convencional:



A PCR convencional é amplamente utilizada para amplificar segmentos específicos de DNA. No entanto, está sujeita a diversos tipos de contaminação, incluindo:



Contaminação Cruzada: Uma das formas mais comuns de contaminação na PCR convencional é a transferência inadvertida de DNA amplificado de uma amostra para outra. Isso pode ocorrer durante a pipetagem das amostras ou ao compartilhar equipamentos entre diferentes reações sem a devida limpeza e descontaminação.



Contaminação do Template: O próprio DNA template utilizado na reação pode ser uma fonte de contaminação. Se o DNA template estiver presente em alta concentração ou se não for manipulado adequadamente, ele pode contaminar os reagentes e os equipamentos, levando a resultados falsos positivos.



Contaminação de Reagentes: Os reagentes utilizados na PCR, como os primers e a Taq DNA polimerase, podem estar contaminados com DNA amplificado de outras reações. Isso pode ocorrer durante o preparo dos reagentes ou devido ao armazenamento inadequado dos mesmos.



Contaminação na PCR em Tempo Real:



A PCR em tempo real permite a detecção e quantificação da amplificação de DNA em tempo real, proporcionando uma maior sensibilidade e precisão. No entanto, também está sujeita à contaminação, que pode se manifestar de diversas formas:



Contaminação da Sonda/Primer: As sondas e primers fluorescentes utilizados na PCR em tempo real podem ser contaminados com DNA amplificado de outras reações. Isso pode resultar em fluorescência de fundo e comprometer a interpretação dos resultados.



Contaminação dos Poços da Placa: Durante a pipetagem das amostras em uma placa de PCR em tempo real, é possível que ocorra contaminação dos poços. Isso pode ser especialmente problemático quando são analisadas múltiplas amostras em uma única placa.



Contaminação do Instrumento: Os instrumentos utilizados na PCR em tempo real, como os termocicladores e os fluorímetros, podem se tornar fontes de contaminação se não forem limpos adequadamente entre as execuções das reações.



Estratégias para Minimizar a Contaminação:



Felizmente, existem medidas que podem ser tomadas para reduzir o risco de contaminação em reações de PCR:



Adotar Boas Práticas de Laboratório (BPL): Manter uma área de trabalho limpa e descontaminada, utilizar equipamentos e materiais estéreis, e seguir técnicas de pipetagem cuidadosas são fundamentais para evitar a contaminação.



Utilizar Controles Negativos: Incluir controles negativos em todas as reações de PCR é uma prática essencial para monitorar a presença de contaminação de reagentes.



Implementar Controles Positivos: Utilizar controles positivos conhecidos para garantir que a reação está funcionando corretamente e para detectar qualquer contaminação que possa ter ocorrido.



Limpar Regularmente os Equipamentos: Limpar e descontaminar os equipamentos, incluindo pipetas e instrumentos de PCR, com soluções desinfetantes adequadas entre as execuções das reações.



Utilizar Tubos e Ponteiras de Qualidade: Utilizar tubos e ponteiras de alta qualidade, livres de nucleases e DNases, pode ajudar a minimizar o risco de contaminação.



A contaminação em reações de PCR, seja convencional ou em tempo real, é um desafio significativo que pode comprometer a precisão e a confiabilidade dos resultados. No entanto, seguindo boas práticas de laboratório e adotando medidas adequadas de controle de qualidade, é possível minimizar esse problema e garantir resultados confiáveis em estudos moleculares. A conscientização sobre os diferentes tipos de contaminação e a implementação de estratégias preventivas são essenciais para o sucesso das análises de PCR e para avanços significativos na pesquisa científica.




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