O ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) é uma técnica amplamente utilizada na biologia molecular e na imunologia para detectar e quantificar uma variedade de substâncias, incluindo proteínas, hormônios, anticorpos e antígenos, em amostras biológicas. Esta técnica baseia-se na interação entre um anticorpo específico e seu antígeno alvo, e sua detecção é geralmente realizada por meio de uma reação enzimática que produz um sinal colorimétrico ou fluorescente. Neste texto, vamos explorar em detalhes os desafios encontrados na realização da técnica de ELISA, desde questões relacionadas à qualidade dos insumos plásticos até limitações dos equipamentos utilizados, além de discutir suas vantagens e desvantagens.


Fundamentos da Técnica de ELISA

O ELISA pode ser realizado em diferentes formatos, incluindo o ELISA direto, indireto, sanduíche e competitivo. No ELISA direto, o antígeno é adsorvido diretamente na superfície da placa, seguido pela adição do anticorpo conjugado com uma enzima que irá gerar um sinal detectável. No ELISA indireto, o antígeno é adsorvido na placa, seguido pela adição do anticorpo primário, seguido por um anticorpo secundário conjugado com uma enzima. O ELISA sanduíche é usado para detectar e quantificar o antígeno presente em uma amostra, onde o anticorpo captura o antígeno entre duas camadas de anticorpos, um primário e um secundário. No ELISA competitivo, um anticorpo é pré-incubado com o antígeno e competirá com o antígeno presente na amostra pela ligação ao anticorpo fixado na placa.


Desafios na Seleção de Insumos Plásticos

A escolha dos insumos plásticos é crucial para o sucesso do ELISA. Placas de micro titulação de alta qualidade são essenciais para evitar contaminações e resultados imprecisos. Os materiais plásticos devem ser inertes e não reativos com os reagentes utilizados na técnica. Além disso, é importante considerar a hidrofilicidade e hidrofobicidade das moléculas presentes nas superfícies dos materiais plásticos, pois isso pode afetar a adsorção de proteínas e a eficiência da ligação entre o anticorpo e o antígeno. A linha de placas para ELISA da SPL Life Sciences, comercializada pela Neobio, oferece 4 opções de superfície de ligação levando em conta a característica da molécula a ser adsorvida, da mais hidrofílica Multibinding, passando pela Maxibinding, recomendada para maioria dos experimentos de ELISA, possuindo regiões hidrofílicas e hidrofóbicas, Medibinding, onde a superfície da placa possui propriedades intermediárias, sendo mais hidrofóbicas que o modelo anterior e finalmente a placa Unibinding, desenvolvida para adsorção de moléculas hidrofóbicas.

Placas para teste de ELISA

Quando a Lavagem Não é Apenas um Simples Enxague

A lavagem das placas de ELISA é um passo crítico na execução do ensaio e desempenha um papel fundamental na obtenção de resultados confiáveis e precisos. Esta etapa é essencial para remover resíduos de reagentes não ligados e não específicos, bem como para reduzir a possibilidade de resultados falsos positivos ou falsos negativos.

Quando a lavagem das placas de ELISA não é realizada de forma correta, podem ocorrer diversos problemas que comprometem a precisão e a confiabilidade dos resultados. Alguns dos problemas mais comuns incluem:

· Contaminação cruzada: Se as placas não forem lavadas adequadamente entre cada etapa do ensaio, pode ocorrer contaminação cruzada entre as amostras, levando a resultados imprecisos.

· Adsorção não específica: Resíduos de reagentes não ligados podem ficar presos à superfície das placas, resultando em adsorção não específica de moléculas durante a etapa de detecção. Isso pode levar a resultados falsos positivos ou negativos, comprometendo a interpretação dos resultados.

· Ruído de fundo elevado: A presença de resíduos não ligados pode aumentar o ruído de fundo do ensaio, reduzindo a sensibilidade e a especificidade do mesmo.

· Variação nos resultados: A falta de lavagem adequada pode resultar em variação nos resultados entre diferentes corridas do ensaio, dificultando a comparação entre amostras e a reprodução dos resultados.

A automação, através do uso de lavadoras automáticas de placas, como a 3D-IW8 Inteliwasher da Biosan, comercializada pela Neobio, apresenta diversas vantagens na qualidade e reprodutibilidade da técnica de ELISA. Estas vantagens incluem:

· Padronização: As lavadoras automáticas de placas permitem a padronização do processo de lavagem, garantindo que todas as placas sejam lavadas de forma consistente e uniforme.

· Redução do erro humano: Ao eliminar a necessidade de lavagem manual das placas, as lavadoras automáticas reduzem o risco de erro humano e aumentam a precisão dos resultados.

· Economia de tempo: O uso de lavadoras automáticas de placas reduz o tempo necessário para realizar o ensaio, permitindo que os pesquisadores se concentrem em outras etapas do processo.

· Reprodutibilidade: A automação do processo de lavagem aumenta a reprodutibilidade dos resultados, tornando mais fácil a comparação entre diferentes experimentos e a reprodução dos resultados em diferentes laboratórios.

Limitações dos Equipamentos de Leitura de Placas de ELISA e Interferências na Amostra

Embora o ELISA seja uma técnica sensível e específica, alguns desafios podem surgir durante sua execução. Primeiramente a técnica de pipetagem e o uso de pipetas não calibradas de forma correta são fatores determinantes na qualidade do resultado final da técnica de ELISA. O uso de ponteiras adequadas, com baixa retenção de líquidos, garantem que uma técnica bem executada entregará os volumes corretos para que a reações não tenha interferentes no resultado.

As limitações dos equipamentos, como leitoras de placas, podem afetar a precisão e a sensibilidade dos resultados. O uso correto de filtros de comprimento de onda, está relacionada diretamente a leitura correta das absorbâncias colorimétricas que a reação de ELISA produz. Além disso, a presença de interferentes na amostra, como lipídios ou outras proteínas, pode levar a resultados falsos positivos ou negativos. Portanto, é importante realizar controles de qualidade adequados e validar os resultados com métodos complementares, quando necessário.

A leitora de microplacas HiPo MPP-96 da marca Biosan, comercializada pela Neobio, apresenta grande precisão nos resultados, possuindo detectores de densidade óptica (D.O) de 3.0 à 4.3 (opcional), permitindo que amplas faixas de leitura sejam realizadas, sem necessidade de diluição da amostra, além disso ela vem com 4 filtros de fábrica comumente utilizados (405, 450, 492, 620 nm) e com possibilidade de expansão para mais 4 filtros, dentre uma gama de mais de 20 diferentes. Sua operação é extremamente simplificada, controlada pelo software QuantAssay, um programa extremamente robusto para realização das mais diversas técnicas, como ELISA qualitativo, semiquantitativo, quantitativo, cinética e multiplexing, entre diversas funções customizáveis, e o melhor, totalmente gratuito, sem assinaturas ou taxas extras.

Vantagens e Desvantagens da Técnica

Apesar dos desafios mencionados, o ELISA oferece diversas vantagens. É uma técnica sensível, específica e versátil, que pode ser adaptada para detectar uma ampla gama de moléculas em diferentes tipos de amostras biológicas. Além disso, o ELISA é relativamente simples de ser realizado e pode processar várias amostras simultaneamente, tornando-o uma ferramenta poderosa para estudos de pesquisa e diagnóstico clínico. No entanto, algumas desvantagens que podem ser encontradas durante a realização desta técnica:

· Heterogeneidade dos pacientes: A condição imunológica do paciente no momento da realização do teste pode influenciar os resultados. Além disso, a diversidade de anticorpos produzidos pelos pacientes pode variar, o que pode levar a variações nos resultados.

· Preparação antigênica: A preparação do antígeno pode influenciar os resultados do teste ELISA1. Se o antígeno não for preparado corretamente, pode não haver uma ligação adequada com o anticorpo, o que pode levar a resultados imprecisos.

· Propriedades intrínsecas das técnicas usadas para pesquisa de anticorpos: Diferentes técnicas podem ter diferentes sensibilidades e especificidades, o que pode levar a variações nos resultados.

· Método de calcular o valor de corte: O valor de corte é um valor limite que determina se um resultado é considerado positivo ou negativo. A escolha do valor de corte pode influenciar os resultados do teste ELISA.

· Tempo e temperatura dos períodos de incubação: No ensaio de ELISA, os tempos e as temperaturas dos períodos de incubação devem ser rigorosamente controlados.

· Realização manual do teste: O teste ELISA é geralmente realizado manualmente, o que pode ser demorado e sujeito a erros humanos.

Conclusão

Em conclusão, a técnica de ELISA é uma ferramenta valiosa e amplamente utilizada na pesquisa biomédica e diagnóstico clínico. No entanto, sua realização bem-sucedida requer atenção aos detalhes e considerações técnicas, desde a seleção dos materiais plásticos utilizados, uso de automação e equipamentos especializados, até a interpretação dos resultados. Ao enfrentar os desafios associados ao ELISA, os pesquisadores e profissionais de laboratório podem garantir a qualidade e confiabilidade dos dados obtidos, contribuindo assim para avanços significativos na área da saúde e biologia molecular.




Para mais informações, entre em contato com a Neobio!

Confira outros artigos autorais da Neobio!

Teste de ELISA, uma ferramenta crucial no diagnóstico de doenças infecciosas
A importância da calibração da leitora de ELISA para resultados precisos.
Calibração de pipetas: precisão em medidas laoratoriais