23/04/2020

Eletroforese em gel de agarose

A eletroforese em gel de agarose é uma das técnicas de laboratório de lifesciences mais comumente executadas. Os pesquisadores usam essa técnica para separar moléculas biológicas com base em seu tamanho. A capacidade de separar moléculas por tamanho pode ser útil em diversas aplicações de pesquisa, como identificar amostras desconhecidas em comparação com resultados conhecidos ou executar precisão ou controle de qualidade durante outros procedimentos.

A eletroforese em gel de agarose é mais comumente usada na separação de moléculas de DNA e, portanto, é frequentemente usada durante técnicas de manipulação de DNA ou estudos envolvendo a identificação de indivíduos com base em sua sequência de DNA. A seguir, discutiremos apenas algumas das aplicações da eletroforese em gel de agarose do DNA, como ele funciona e quais equipamentos são necessários para executar a técnica.


Como funciona?



Estrutura química dna

Figura 1: A estrutura química do DNA.

O DNA tem uma estrutura química distinta, na qual as bases nitrogenadas, as letras do código do DNA (A = Adenina, T = timina, C= Citosina, G = Guanina), são unidas por uma estrutura química formada por um açúcar chamado desoxirribose e um grupo fosfato. Essa estrutura é mostrada na figura 1. Como pode ser visto na figura, A estrutura química do DNA contém uma carga negativa para cada base nitrogenada presente, de forma que a proporção massa/carga elétrica do DNA, seja a mesma em diferentes tamanhos de fragmento. Devido a essa carga negativa, quando aplicamos um campo elétrico a uma solução contendo DNA, as moléculas de DNA migram para o eletrodo carregado positivamente.



A Matriz de Gel

Na eletroforese em gel de agarose, é utilizada uma matriz de gel. Imagine várias camadas de peneiras ou redes, pelas quais o DNA migra ao longo do gradiente elétrico, em direção ao eletrodo positivo. Essa matriz cria uma resistência, onde moléculas menores migram mais rapidamente, enquanto moléculas maiores migram mais lentamente. A diferença na taxa de migração é como separamos os diferentes tamanhos da molécula de DNA para determinar seu peso molecular. A matriz do gel é criada dissolvendo-se um polissacarídeo natural chamado agarose, que é derivado de um tipo de alga marinha, em um tampão condutor, na proporção aproximada de 1% a 3% de agarose. O tamanho dos poros nesta matriz de gel é bem adequado para a separação do DNA e a velocidade da migração pode ser influenciada pelo aumento ou diminuição da porcentagem de agarose na mistura.

Executando o gel





Figura 2: Execução de um gel de eletroforese em agarose. 1 - os poços são formados usando pentes durante o vazamento. 2-4 amostras são carregadas com uma pipeta. 5-6 - O campo elétrico é aplicado para separar as amostras.

Para um procedimento típico de eletroforese é necessário utilizar um gel de agarose. Pentes de plástico das cubas de eletroforese são usados para criar poços no gel, nos quais as amostras são inseridas. O DNA deve ser misturado a um corante de carregamento, geralmente o azul de bromofenol, que auxilia a visualização das moléculas durante a corrida. Geralmente, as amostras são testadas ao lado de um DNA ladder, que contém pesos moleculares de DNA conhecidos, para fins de controle experimental. O gel é colocado em um recipiente, chamado cuba de eletroforese, que é preenchida com uma solução tampão condutora, geralmente Tris-acetato-EDTA ( tampão TAE) ou Tris-Borato-EDTA (taapão TBE). É na cuba de eletroforese que é criado o campo elétrico que força a migração das moléculas através gel de agarose das moléculas negativas para o polo positivo. O processo está resumido na figura 2.

A velocidade da migração através do gel é determinada pelo gradiente de voltagem, isto é, a voltagem entre os eletrodos. A força de campo necessária está relacionada ao tamanho da cuba de eletroforese utilizada e a voltagem necessária pode ser calculada usando a equação: E = V / d, onde "E" é a força de campo, "V" a voltagem e "d" a distância em centímetros entre os eletrodos. As cubas horizontais de gel geralmente funcionam entre 5 - 10 V / cm; portanto, se o seu tanque tiver uma distância de eletrodo de 10 cm, você deve executar a corrida de eletroforese entre 50 - 100V. O valor exato depende das suas amostras e deve ser determinado empiricamente.

Para aplicar esse campo elétrico, usamos uma fonte de eletroforese. A maioria das fontes de energia de eletroforese pode ser configurada para fornecer uma voltagem, corrente e potência constantes, cada uma com vantagens e desvantagens. No entanto, como a eletroforese em gel de agarose utiliza um sistema tampão para a condução da energia entre o ânodo e o cátodo, a variação desses parâmetros produzirá os mesmos resultados. Podemos simplesmente definir a fonte de alimentação para voltagem constante, com base no tamanho do tanque, conforme descrito acima.

Uma questão em potencial é a produção de calor devido ao fluxo de corrente através do sistema, que pode ser especialmente alto com fontes maiores que requerem voltagem mais alta. Por esse motivo, é aconselhável usar alguma forma de resfriamento, passivo na forma de um bloco de resfriamento ou ativo como um chiller de recirculação, para sistemas de eletroforese maiores.


Aplicações:

Dada a natureza simples dessa técnica, os cientistas podem aplicá-la a uma ampla gama de estudos, alguns dos quais são discutidos abaixo.

Clonagem Molecular

Provavelmente, a aplicação mais frequente da eletroforese em gel de agarose é na clonagem molecular. Esta é a construção de moléculas de DNA recombinante que são integradas em vários organismos para criar modificações genéticas. O objetivo dessas modificações varia e pode incluir a produção de uma biomolécula específica. Por exemplo, a produção de insulina na indústria farmacêutica. Outras aplicações da clonagem molecular incluem a adição de fusões de proteínas fluorescentes às proteínas celulares existentes para estudar sua localização nas células, e a criação de novos circuitos genéticos para realizar funções específicas, como a quebra de toxinas.

Reação de PCR

Qualquer que seja o produto final desejado, a eletroforese é uma etapa fundamental na produção e no controle de qualidade dos fragmentos de DNA usados na clonagem molecular. A eletroforese pode ser usada para analisar os fragmentos criados por reação em cadeia da polimerase (PCR) ou digestão de restrição, para garantir que eles tenham o tamanho correto. Também pode ser usado para purificar fragmentos, executando-os no gel e subsequentemente cortando a banda de interesse e purificando o DNA da agarose.

DNA Fingerprintings

Combinada com a PCR, a eletroforese em gel de agarose pode ser uma técnica poderosa para identificar indivíduos com base em seu código genético. O genoma humano contém muitas regiões de repetições curtas, cujo número varia exclusivamente entre indivíduos. A utilização com primers específicos permite a definição de regiões específicas a serem amplificadas. Por consequência, será criado um perfil de banda específico para cada indivíduo, permitindo a comparação das amostras de diferentes indivíduos. Essa técnica, conhecida como DNA Fingerprinting, pode ser usada em áreas como forense para investigações criminais, genealogia e testes de paternidade.

Diagnóstico

A eletroforese pode ser usada em vários testes de diagnóstico, principalmente na triagem de distúrbios genéticos, mas também para identificar proteínas anormais. O DNA pode ser extraído de pacientes ou mesmo de embriões para triagem pré-implantação. A eletroforese em gel de agarose para confirmar a presença de certos genes ou anormalidades genéticas. A eletroforese em gel de agarose também pode ser aplicada a algumas proteínas, por exemplo, para estudar a química do sangue para determinar a adequação de certos tratamentos médicos.

A ampla gama de aplicações, tanto acadêmicas quanto clínicas, fazem da eletroforese em gel de agarose uma técnica extremamente importante. Embora o recente advento das tecnologias de sequenciamento de próxima geração tenha o potencial de substituir muitos aplicações atuais dos géis de agarose. Porém, é uma técnica relativamente barata, sua facilidade e versatilidade indicam que é provável que essa técnica continue sendo utilizada no futuro.


Equipamento para eletroforese em gel de agarose

A popularidade da eletroforese em gel de agarose se deve em parte à sua simplicidade. O equipamento necessário é economicamente acessível, fácil de usar e requer pouco treinamento para operá-lo corretamente.

Os principais componentes são discutidos abaixo.

Cuba de Eletroforese (link do produto)

cubas de eletroforese

A cuba de gel , também chamada de cuba de eletroforese, é o principal componente do sistema de eletroforese em gel de agarose horizontal. Geralmente, a cuba de gel consiste em um recipiente de plástico com uma plataforma central elevada, onde o gel é colocado em um suporte secundário chamado bandeja de gel. Em cada extremidade da cuba, eletrodos feitos de um material condutor inerte, mais comumente platina, são fixados e conectados aos conectores para permitir a conexão à fonte de alimentação. Finalmente, uma tampa fica no tanque de gel para impedir o acesso à câmara enquanto a alta tensão é aplicada ao buffer.

A Cleaver Scientific fabrica tanques de gel em vários tamanhos para diferentes aplicações. A Neobio é a distribuidora oficial da Cleaver Scientific no Brazil. Dê uma olhada na tabela de seleção e navegue em nossas páginas de produtos para obter mais informações.


Fonte de energia (link do produto)

Fontes de Energia

Para geral um campo elétrico ao gel, você precisará de uma fonte de alimentação de eletroforese. Essas fontes de alimentação são fabricadas especificamente para aplicações de eletroforese e apresentam saídas de tensão e corrente muito estáveis para evitar flutuações na velocidade durante as corridas. Uma boa fonte de eletroforeseo permite que você defina corrente ou voltagem constantes, dependendo da necessidade do experimento, e fontes mais avançadas permitirão a programação de etapas individuais com diferentes valores de parâmetros.

Na Cleaver Scientific, temos uma variedade de fontes de alimentação por eletroforese para todas as aplicações. A série PowerPRO de fontes de alimentação é uma gama versátil projetada para alimentar tanques de eletroforese horizontal multiSUB e omniPAGE vertical. Cada fonte de alimentação possui um display LCD de 2,4 ″. Opções de voltagem constante, corrente e potência estão disponíveis, bem como condições pré-programadas ou programadas pelo cliente, permitindo que os usuários salvem e repitam suas experiências para uma reprodutibilidade excepcional.

Sistema de documentação em gel (link do produto)

Sistemas de Fotodocumentação em Gel

Para o estágio final da técnica, a captação de imagens do gel, você precisará de um sistema de documentação em gel, conforme descrito acima. A Cleaver Scientific possui toda uma gama de gel documentadores para atender a qualquer orçamento ou necessidade. Dê uma olhada no nosso guia de seleção para encontrar a melhor opção para você e navegue em nossas páginas de produtos para obter mais informações.

Reagentes para eletroforese

Para executar uma corrida de eletroforese em gel, você precisará do equipamento e dos reagentes.

Os reagentes básicos necessários para a eletroforese em gel de agarose são:

Agarose grau biologia molecular

Tampões TAE ou TBE

Corante de carregamento

DNA Ladders

Corante intercalante de DNA para visualização no sistema de fotoducmentação

A Neobio fornece todos esses reagentes. Dê uma olhada em nosso site em reagentes para Biologia Molecular.